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  3. 重测序通过对已知基因组序列的物种的不同个体的全基因组重测序,检测每个个体或群体在基因组水平的SNP/InDel/CNV/SV等突变信息,并在此基础上探索与疾病、物种演化相关的编码区域内的结构变异。

    Nanopore三代重测序在重测序的基础上使用Nanopore测序技术,借助单个分子通过纳米孔时引起孔两侧的电位差来识别ATGC四种核苷酸,完成对一条双链DNA的长度长测序。该技术可以跨越结构变异断点、串联重复序列、高GC/AT序列等特殊区域进行测序,同时避免PCR扩增可能引入的错误碱基读取,对于各种变异的检测能力得到了显著提升。

     

     
    应用领域
    1. 已知候选位点筛选及验证;
    2. 稀有或新变异位点检测;
    3. 个性化诊断;
    4. 药物靶点筛??;
    5. 功能突变位点定位;
    6. DNA表观修饰研究。
     
     
     
     
    技术路线

     

    分析内容

    标准信息分析

    1. 数据质控(原始数据过滤、碱基组成及质量分析);

    2. 与参考序列进行比对、统计测序深度及覆盖度;

    3. 变异检测(circos图展示、SV/CNV统计);

    4. 差异分析(差异SV分析、GO/KO富集分析)。

     

     

    样品要求

    DNA浓度≥100ng/μL,DNA总量≥20μg;样本无 RNA 污染,条带清晰,无降解。

     

     

    项目周期

    标准流程完成时间为55个工作日

     

     

    参考文献

    [1] Wick R R, Judd L M, Holt K E. Performance of neural network basecalling tools for Oxford Nanopore sequencing[J]. Genome biology, 2019. 20(1): 129.
    [2] Sedlazeck F J, Rescheneder P, Smolka M and et al. Accurate detection of complex structural variations using single-molecule sequencing[J]. Nature Methods, 2018. 15(6):461-468.
    [3] De Coster W, De Rijk P, De Roeck A and et al. Structural variants identified by Oxford Nanopore PromethION sequencing of the human genome[J]. Genome research, 2019. 29(7): 1178-1187.
    [4] Euskirchen P, Bielle F, Labreche K and et al. Same-day genomic and epigenomic diagnosis of brain tumors using real-time nanopore sequencing[J]. Acta Neuropathologica, 2017. 134(5):691-703.

     

     

     

    Q1: 纳米孔测序原理?

    A:Nanopore测序是将人工合成的一种多聚合物的膜浸在离子溶液中,多聚合物膜上布满了经改造的穿膜孔的跨膜通道蛋白(纳米孔),也就是Reader蛋白,在膜两侧施加不同的电压产生电压差,DNA链在马达蛋白的牵引下,解螺旋通过纳米孔蛋白,不同的碱基会形成特征性离子电流变化信号。该膜具有非常高的电阻。通过对浸在电化学溶液中的膜上施加电势,可以通过纳米孔产生离子电流。进入纳米孔的单分子引起特征性的电流干扰,这被称为Nanopore信号。

    纳米孔是对穿过的片段进行测序,而不管DNA片段的长度如何。而不是生成特定长度的序列,这可能是数百个碱基、或者更多个碱基的序列。Nanopore的长序列简化了重复区域的组装和测序,也提高了物种鉴定和宏基因组实验的速度。

     

     

    Q2: Nanopore测序的应用领域?

    A:  大基因组拼接 ;细菌完成图;全长无偏倚基因组 ;大片段变异;突变定向分析;微生物快速鉴定

     

     

     

     

    人们一度认为线虫和果蝇中即便不是不存在但也不会多见的DNA甲基化表观遗传标记,实际上普遍存在于这些生物体的整个基因组,且其并非发生于在哺乳动物中常见的胞嘧啶上而是在腺嘌呤上。芝加哥大学的何川教授研究小组与哈佛医学院施扬教授的课题组合作,证实线虫中存在DNA甲基化。研究人员利用斑点印迹分析,在秀丽线虫中发现了6-mA甲基化,并利用三代测序SMRT-Seq方法检测出225586个6-mA甲基化位点,这些甲基化位点在整个基因组内均匀分布,并且两段motif序列与6-mA显著相关:AGAA和GAGG。同时鉴定出一个6-mA去甲基化酶和一个6-mA甲基化酶,这些酶和6-mA一起参与了线虫跨代遗传,揭示了6-mA在表观遗传方面的可能性。

    图1 线虫SMRT测序的IPD ratio(荧光脉冲信号延迟)

     

     

    参考文献:

    Greer E L, Blanco M A, Gu L, et al. DNA Methylation on N 6-Adenine in C. elegans[J]. Cell, 2015, 161(4): 868-878.