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  3. DNA亲和纯化测序(DAP-seq,DNA Affinity Purification sequencing),通过体外构建表达转录因子(TF,Transcription Factor)蛋白,与目标基因组片段结合,针对把目的蛋白所结合的基因组DNA片段进行富集。通过与高通量测序技术的结合,对DAP后的DNA产物进行测序分析,从全基因组范围内寻找目的蛋白的DNA结合位点,以高效率的测序手段得到高通量的数据结果。
     
    DAP能够有效解决CHIP技术缺乏目的蛋白特异性抗体的限制,适用范围更广。

     

    应用领域

    1. 转录因子结合位点和功能研究;
    2. 判断DNA链的某一特定位置组蛋白修饰的类型;
    3. 组蛋白共价修饰与基因表达的关系的研究。

     

     

    技术路线

     

    分析内容

    标准信息分析
    (需提供参考基因序列、参考基因组序列及基因注释结果)
    1  测序评估: 测序质量评估、碱基组成与质量分析、过滤信息统计
    2  比对分析:比对基因组统计、Reads在染色体上的分布、测序深度与饱和度分析
    3  Peak分析:Peak calling、Peak长度分布、Peak深度分布、Peak富集倍数分布
    4  Peak注释:Peak 相关基因分析、Peak在基因功能元件上的分布、Peak相关基因的GO/Pathway功能富集分析
    5  motif 分析
    6  各处理组peak合并及多样本聚类:peak丰度计算、PCA分析、相关性热图分析
    7  处理组共有特有peak分析:比较组共有特有peak及相关基因统计、GO富集分析、KO富集分析
    8  组间peak差异分析:差异peak统计、组间差异peak相关基因分析、GO富集分析、KO富集分析

     

    样品要求

    目的蛋白载体质粒:≥12 μg(质粒浓度为200 ng/μL)
    DNA样品:总量≥1 μg(浓度≥30 ng/μL)
    组织样品:≥1 g
     
     
    项目周期
    60工作日

     

    参考文献

    [1] Omalley R C, Huang S C, Song L, et al. Cistrome and epicistrome features shape the regulatory DNA landscape[J]. Cell, 2016, 165(5): 1280-1292.
    [2] Bartlett A, Omalley R C, Huang S C, et al. Mapping genome-wide transcription-factor binding sites using DAP-seq[J]. Nature Protocols, 2017, 12(8): 1659-1672.
    [3] Stigliani A, Martinarevalillo R, Lucas J, et al. Capturing Auxin Response Factors Syntax Using DNA Binding Models[J]. Molecular Plant, 2019, 12(6): 822-832.
     

     

     

     

    Q1和ChIP-seq相比,DAP-seq有什么样的优势?

    A:DAP-seq在体外构建表达目标转录因子蛋白,与DNA在体外结合,之后进行纯化、测序。ChIP-seq则是在蛋白与DNA体内结合的基础上,利用蛋白特异性抗体捕捉与蛋白结合的DNA片段,进行后续的纯化与测序,因此两者最大的差别在于是否需要转录因子蛋白特异性抗体。

     

    Q2每种转录因子都可以做DAP-seq吗?

    A:不是的,某些基因家族成功率高,某些基因家族成功率低,因此客户可以先将感兴趣的转录因子信息反馈给我们公司,对该基因家族DAP-seq成功率做出初步评估,评估通过后进行后续的实验。

     

    Q3没有参考基因组的物种可以做DAP-seq吗?

    A:不可以,当前没有参考基因组的物种不能做DAP-seq。

     

     

     

     

    DAP-seq+RNA-seq)柿子性别控制转录因子MeGI研究

    转录因子MEGI能够调控柿子成花性别,MEGI的目标靶基因及其调控网络关系的研究对于柿子花性别形成的机制的理解至关重要。本研究将柿子花形成分为四个时期,分别采集第一阶段(器官分化之前)、第三阶段(器官成熟)的柿子雄花和雌花样本进行RNA-seq测序、DAP-seq测序。首先,通过转录组数据筛选雄花、雌花间的差异表达基因,发现在器官分化阶段目标转录因子基因ME G I在雌花中高表达,且与雌花中高表达的基因(S V P, KNAT1等)成正向相关的关系,与雄花高表达基因(AP、PI等)呈现负向相关的关系。差异基因共表达网络构建发现,雌花高表达基因??镸1与转录因子MEGI表达相关性最强,其中共有五类基因表达与MEGI基因直接相关。

    通过体外构建表达MEGI蛋白,进行DAP-seq测序,找到MEGI结合motif:AATWATT, SVP,KNOX ,OFP等基因启动子区域均有该motif,说明MEGI转录因子蛋白能直接结合这些雌花高表达基因。最后配合下游的过表达实验,发现过表达组拟南芥的花瓣、花药发育被抑制,雌花相关基因SVP表达量显著上升,雄花相关基因PI显著减少,说明MeGI能够通过靶向结合雌花相关基因促进基因表达,抑制雄花相关基因表达,从而达到性别调控的功能。

     

     

     

     

    参考文献

    Ho-Wen, et al. “Gene networks orchestrated by MeGI: a single-factor mechanism underlying sex determination in persimmon. ” The Plant journal : for cell and molecular biology (2018).