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    Smart-seq2 单细胞转录组测序通过 SMART 扩增技术对单个细胞中的 mRNA 进行逆转录和 PCR 扩增,结合转座酶建库技术,最终使用高通量测序手段,对单细胞中 mRNA 进行基因表达定量、功能富集、代谢通路等分析。它可以解决传统 RNA 定量技术在早期胚胎发育、干细胞、癌症、免疫等研究领域中存在的样品量极低或细胞异质性的问题,是在单细胞水平研究基因表达强有力的工具,极大地拓展了RNA-Seq 的应用范围。
     
     
     
     
    应用领域
     
    1. 单个细胞样本全转录本信息获??;
    2. 基因注释及筛??;
    3. 基因结构分析。
     
     
     

     

    技术路线

     

     

    分析内容

     
    标准信息分析(需提供参考基因序列、参考基因组序列及基因注释结果) 高级信息分析 定制化信息分析

    1. 测序质量评估与原始数据过滤,去除接头序列及低质量reads;

    2. 比对参考基因组或参考基因序列;

    3. 测序与比对评估:数据比对统计,测序饱和度分析,测序随机性分析;

    4. 基因表达统计:基因覆盖度,表达量,表达量丰度分布;

    5. 新基因的转录本预测及注释(需有参考基因组);

    6. 样本关系分析:主成分分析(PCA)、相关性检验、样本聚类图;

    7. 差异表达基因分析:差异表达基因筛选,差异基因表达模式聚类分析(热图),差异基因GO功能富集分析、KEGG通路富集分析、DO基因疾病富集分析(人)、Reactome通路富集分析(人、大鼠、小鼠);

    8. String数据库蛋白互作网络分析;

    9. GSEA基因集富集分析。

    1. SNP分析;

    2. 基因结构优化(需有参考基因组);

    3. 基因可变剪切鉴定(需有参考基因组)。

    1. 基因表达趋势分析(需要三个或以上有处理梯度的样品):利用STEM软件将基因按照表达模式分为不同的趋势、各趋势基因的GO/KEGG功能富集分析、特定基因集聚类分析;

    2. 权重基因共表达网络分析(WGCNA)(至少15个样本):根据基因表达模式进行??榛?、样本表达模式分析、??榛虮泶锬J椒治?、性状-??橄喙匦苑治?、各??榛虻?span lang="EN-US">GO/KEGG功能富集分析、基因间调控关系网络图。

     

     

     

    样品要求

    样本分离:客户制备分离单细胞;

    样本类型:新鲜活体完整细胞,不适于经固定、染色等处理的样本;哺乳动物细胞或其他无细胞壁结构的真核细胞,mRNA具有poly-A结构。

    样本体积:细胞悬液体积不高于1μL为宜;

    送样量:推荐1~500个单细胞/样本,生物学重复不少于3个。

     
     
     
     
    项目周期
    标准流程完成时间为50个工作日。
     
     
     
     
    参考文献

    [1] Picelli S, Faridani O R, Björklund Å K, et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2[J]. Nature protocols, 2014, 9(1): 171.

    [2]Yan L, Yang M, Guo H, et al. Single-cell RNA-Seq profiling of human preimplantation embryos and embryonic stem cells[J]. Nature structural & molecular biology, 2013, 20(9): 1131.

    [3]Usoskin D, Furlan A, Islam S, et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing[J]. Nature neuroscience, 2015, 18(1): 145. Björklund Å K, Forkel M,

    [4] Picelli S, et al. The heterogeneity of human CD127+ innate lymphoid cells revealed by single-cell RNA sequencing[J]. Nature immunology, 2016, 17(4): 451.

     

     

     

    Q1: 10X单细胞转录组与smart-seq技术的区别和优劣势在哪里?

    A:核心区别在于通量高低和研究内容不同,10×通量更高,smartseq可以做定量还可以做转录本结构分析。

     

    Q2: 如果研究的样本细胞比较大(骨骼肌、心肌、破骨细胞、脂肪细胞)怎么做单细胞测序?

    A:第一,提核后做单细胞转录组;第二,做smart-seq的单细胞转录组。

     

     

     

     

     

    案例一:Sm art-seq2揭示人cn 121+先天淋巴细胞的异质性

    先天性淋巴细胞 (IL C s) 被认为是体内平衡和炎症的重要参与者。研究表明,IL C 群体具有可塑性和异质性。

    流式分选患有阻塞性睡眠呼吸暂停综合症患者扁桃体组织中648个IL C s和自然杀伤细胞 (N K cells) , 并进行Smart-seq2测序。细胞聚类为4个亚群:ILCl 、IL C 2、IL C 3、NK , 差异分析结果显示共有差异基因的表达量在C D 127+ IL C s中要明显高于比N K 细胞;对IL C 3中1,958个免疫基因进— 步分析,发现了新的免疫细胞类型C D 62L + ILC3。

     

    案例二:lOx scRNA-seq联合Smart-seq2绘制小肠细胞图谱

    肠道发挥着很多功能,它依赖千很多特化细胞的特定活性和细胞间的相互作用。其中的一 些细胞是众所周知的,但有些细胞至今仍不熟悉。

    首先利用 l Ox scRNA-seq 分析了从小鼠小肠或肠道类器官中分离的 53193 个 EpC A M + 上皮细胞,细胞聚类成 15 个clusters; 利用 Smart- seq2 分析 1522 个上皮细胞,验证了 l Ox scRNA-seq的数据,并且每个细胞具有更高的覆盖。聚类分析确定了8 个簇,与基千 l Ox 的聚类一 致,但由千细胞数量较少,肠上皮细胞没有更好地区分开。同时文章分析了每种细胞类型的表达特征,包括验证已知的 marker 基因和鉴定新的marker 基因。

     

    参考文献:

    [1] Bjorklund AK, Forkel M, Picelli S, et al. The heterogeneity of human CD127+ innate lymphoid cells revealed by single-cell RNA sequencing[J]. Nature Immu- nology, 2016

    [2] Haber AL, Biton M, Rogel N, et al. A single-cell survey of the small intestinal epithelium[J]. Nature, 2017