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  3. 10X Visium空间转录组结合组织学的形态观察优势和转录组学的高通量测序优势,完成对一张组织切片的多个位点的高通量测序。该技术借助高通量测序数据和组织原位barcode标记构建空间表达图谱,解释不同组织位置的异质性,实现了从基因表达到组织区域的对生命表型特征的全面解析,为细胞微环境、细胞间信号通路和空间异质性研究提供了全新的解决方案。

     

     

    应用领域

    1. 组织原位表达图谱构建;
    2. 空间异质性分析;
    3. 肿瘤微环境研究;
    4. 疾病病理进程研究;
    5. 发育生物学。

     

     

    技术路线

     
    分析内容
     
    标准信息分析 高级信息分析
    1. 测序数据统计与评估:各个样本测序数据基本质控(reads数、测序饱和度等)、各个样本数据比对(组织覆盖区域检测、reads基因组比对率等)、基因表达定量;
    2.  spot聚类分析及数据可视化:spot聚类分群、亚群spot数量统计、spot亚群基因表达量统计、分群结果可视化(组织映射图,tSNE映射图);
    3. 亚群特征基因分析:亚群上调基因筛选、功能富集分析,亚群特征基因筛选、基因分布特征可视化、蛋白质互作网络图;
    4. 空间特征基因分析:空间差异基因筛选、功能富集分析,空间特征基因筛选、基因分布特征可视化、蛋白质互作网络图。
     
    拟时分析
    与单细胞转录组关联分析

     

     

     

    样品要求

    1.冷冻包埋

    样本类型:制备好的冷冻包埋样本;

    组织规格:组织切面面积小于6.5mm×6.5mm2,组织加包埋剂切面面积小于10mm×10mm2;

    样本质量:如果有条件,进行样本RNA质控。速冻前或速冻后,样本提取RNA质检结果RIN≥7。

    2.石蜡包埋(FFPE

    样本类型:制备好的石蜡包埋样本,已经完成包埋的样本保存时间小于3年;

    组织规格:组织切面面积小于6.5×6.5mm2,组织加包埋剂切面面积小于10×10mm2,组织厚度3~5mm;

    样本质量:如果有条件,进行样本RNA质控。要求RNADV200 > 50%DV200RNA片段长度大于200nt的比例)。

     
     
     
     
    参考文献

     

     

    [1] Ståhl P L, Salmén F, Vickovic S and et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics[J]. Science, 2016. 353(6294):78-82.

    [2] Berglund E, Maaskola J, Schultz N and et al. Spatial maps of prostate cancer transcriptomes reveal an unexplored landscape of heterogeneity[J]. Nature Communications, 2018. 9(1):2419.

    [3] Asp M, Giacomello S, Larsson L and et al. A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart[J]. Cell, 2019. 179(7):1647-1660.e19.

    [4] Maniatis S, Äijö T, Vickovic S and et al. Spatiotemporal Dynamics of Molecular Pathology in Amyotrophic Lateral Sclerosis[J]. Science, 2019. 364(6435):89-93.

    [5] Fischer AH, Jacobson KA, Rose J and et al. Paraffin embedding tissue samples for sectioning[J].. CSH Protocols, 2008.

     

     

    Q1: 空间转录组的样本保存建议?

    A:(1)速冻后的样本放在异戊烷中,冻在-80℃;(2)包埋后未切片的样本放在-80℃。包埋样本保存时注意密封,防止长期保存造成脱水。

     

     

     

    Q2: 空间转录组切片制备后,染色方法支持哪些?

    A:HE染色(动物组织)和甲苯胺蓝染色(植物组织)。

     

     

     

    Q3: 空间转录组送样的时候,有什么注意事项?

    A:1)组织冷冻过程中避免组织直接接触液氮,引起沸腾,导致速冻不均匀

    2)异戊烷在液氮中放置不宜超过10min,否则异戊烷会凝固无法完成组织速冻

    3)冷冻包埋盒先做标记,确定包埋盒中的样本名称,包埋后组织不可见,无法记录

    4)组织放入包埋剂时建议目标切面朝下,方便后续切片时寻找目标切面

    5)整个包埋过程避免气泡出现

    6)保存时注意密封,避免组织脱水

     

     

    Q4: 空间转录组对测序深度的要求?

    A:根据组织切片占捕获区域的比例计算测序量。计算测序量的时候,只需考虑被组织切片覆盖的spot,每个spot推荐最低起始测序量是5w PE read pairs。如果全覆盖,则数据量为5000×5w×300=75g。

     

     

    Q5:10x Visium空间转录组与GeoMx DSP空间转录组有什么区别?

    A:

     

     

     

     

    案例一 肌萎缩性侧索硬化症致病机制

    受限于基因表达谱技术,肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的疾病起因和扩散原理都未得到很清晰的阐述。鉴于脊髓固有的细胞组成和胞间通信在AL S病程中的重要作用,S T的优势在AL S发生和发展领域得到了发挥,帮助研究者探索ALS的致病机制。

    文章以非ALS疾病小鼠(SOD1-WT)、ALS模型鼠(SOD1-G93A)和ALS抗性鼠(Atg7 cKO)构建基因空间表达图谱,通过已知致病基因的表达特征验证了表达图谱的可靠性。为了进一步挖掘致病相关基因和细胞类型,文章将基因以空间表达特征和单细胞表达谱系为依据划分为若干modules,并对各个modules做了富集分析,得到了由胶质细胞的溶酶体、鞘脂类信号通路激活引起的ALS致病途径。

    图1 小鼠脊柱空间表达图谱

     

     

     

     

    案例二 人类心脏发育空间表达图谱

    图2 心脏高分辨率图谱及心脏神经嵴细胞的表达特征及验证

     

    心脏是人类胚胎中第一个发挥功能的器官,其发生、发育和成熟过程受到研究者的广泛关注。近几年随着单细胞转录组技术的迅猛发展完成了心脏发育过程中的重要细胞类型变化和基因表达变化的解析。但是,不同类型的细胞,如何在合适的时间和空间表达合适的基因推进心脏的成熟,依然没有得到解答。

    文章使用S T对怀孕后4.5周、6.5周和9周的胎儿心脏绘制空间表达图谱,并借助scRNA-seq进一步提高了图谱分辨率。借助这一图谱,作者发现心脏神经嵴细胞标记基因在早期心脏流出道形成过程中的高表达;此外,三种特殊的心肌细胞在图谱中得到描述,其中两种分别集中在心房和心室并具备相应的基因表达特征,另一种心肌细胞分布于心房和心室但是特异性表达MYOZ2基因,该类心肌细胞此前只在小鼠中有报道。

     

     

    参考文献:

    [1] Maniatis S, Äijö T, Vickovic S and et al. Spatiotemporal dynamics of molecular pathology in amyotrophic lateral sclerosis. [J] Science, 2019. 364(6435):89-93.

    [2] Asp M, Giacomello S, Larsson L and et al. A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart. [J] Cell, 2019. 179(7):1647-1660.