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  3. 靶向代谢组学(Targeted metabolomics)针对特定某一物质或某一类代谢物进行检测的代谢组方法,具有特异性强、检测灵敏度高和定量准确等优点。利用AB SCIEX 5500 QQQ UPLC-MS液质联用仪可检测到含量更低代谢物,应用范围更广。通过与标准品的比对分析等获得目标代谢物的绝对丰度信息。随着分析研究的逐步深入,代谢网络逐渐全面系统,生物学研究趋于具体代谢通路的细节探索。靶向代谢组学即在精细化的代谢组学研究中发挥着重要作用。

     

    应用领域

    植物代谢组:用于植物主要和次生代谢途径、植物病虫抗性机理、植物微生物相互作用等研究;

    食品代谢组:用于食品营养功能评估、食品安全评估等;

    临床代谢组:揭示疾病的分子机理,寻找早期诊断的血液和尿液标记物,肠道和口腔代谢等。

     

     

    靶向代谢化合物检测部分列表:

     

     

     

    技术路线

     

     

    分析内容

    标准信息分析 定制化信息分析

    a) 物质标准曲线绘制

    b) 原始数据预处理

    c) 物质绝对定量

    a) 多组学数据关联分析

     

     

     

    样品要求

    1. 植物组织:1g鲜重,500mg干重,液氮速冻,-80°保存。

    2. 动物组织:250mg 鲜样,液氮速冻15min,-80℃保存。

    3. 血清、血浆:200μL,4℃或冰浴静置10 min后低温低速离心,取上层血清/血浆,避免溶血,液氮速冻15min,-80℃保存。

    4. 粪便、肠道内容物:250mg鲜样,液氮速冻15min,-80 ℃保存。

    5. 尿液:1ml,低温离心取上清,液氮速冻15min,-80 ℃保存。

    6. 体液、细胞培养液:500μL,液氮速冻15min,-80 ℃保存。

     

     

    项目周期

    标准项目的运转周期约50个工作日

     

    参考文献

    [1].Wang, Rui, et al. "Identification of novel pathways for biodegradation of bisphenol A by the green alga Desmodesmus sp. WR1, combined with mechanistic analysis at the transcriptome level." Chemical Engineering Journal.321 (2017): 424-431.
    [2].Tieman D, Zhu G, Resende M F R, et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor[J]. Science, 2017, 355(6323): 391-394.
    [3].Yu C, Zhao X, Qi G, et al. Integrated analysis of transcriptome and metabolites reveals an essential role of metabolic flux in starch accumulation under nitrogen starvation in duckweed[J]. Biotechnology for Biofuels, 2017, 10(1): 167.
    [4].Liu K, Feng S, Pan Y, et al. Transcriptome Analysis and Identification of Genes Associated with Floral Transition and Flower Development in Sugar Apple (Annona squamosa L.)[J]. Frontiers in Plant Science, 2016, 7.
     

     

     

    Q1: 如何评判样本能否做代谢组或蛋白组(比如-80℃保存了两年、或者用麻醉剂进行处理)?

    A: 针对这种情况要咨询公司销售,评估样本的可检测性。一般情况下,样本-80℃保存半年对蛋白、代谢检测影响不大,可正常使用。如果保存时间更久,可与销售咨询,进行预实验,通过预实验的检测结果判断样本情况。

     

     如果使用麻醉剂等试剂对样本进行预处理,对物质检测结果一定会有影响的。

     

     

     

    Q2蛋白、代谢检测可否分批送样?

    A: 不建议分批送样,因为仪器稳定性、实验操作人员不同、质谱仪保养清洁等原因会导致不同批次检测结果出现明显的批次效应,且批次效应很难消除,有时批次间的差异会大于样本间的差异。如果真的由于试验需要时间梯度或者样本自身原因,建议先取样,用液氮猝灭后至于-80℃保存,等到所有样本收集完再统一检测。

     

     

     

    Q3代谢组检测时什么是外标?什么是内标?如果检测时添加了内标就是内标法检测吗? 

    A: 外标是指代谢物检测时,使用的与待检物质一致的标准品。因为标准品的浓度和上机检测量是已知的,用不同浓度的标品,构建标曲获得峰面积,之后利用标曲的峰面积,标曲浓度、待检物质的峰面积可推算出待检物质浓度,实现待检物质的绝对定量和定性。

     

    内标是指代谢物检测时,用到的是待检物质的同位素。同位素与待检物质一起上机检测。因为同位素的浓度和上机量已知,可根据同位素的峰面积和待检物质的峰面积推测待检物质含量,实现待检物质的相对定量和定性。添加内标不一定是内标法检测。有些公司会使用“外标+同位素内标绝对定量”,这种情况下,外标用于待检物质的绝对定量和定性,内标用于矫正样本量不容导致的定量差异,消除基质对定量的影响。

     

     

     

     

    代谢工程提高微藻产油量

    合作单位:暨南大学

    发表期刊:《Metabolic Engineering》

    影响因子IF: 8.142

     

    研究背景

    三角褐指藻,参考基因组已经公布?;诨蜃樾畔?,研究者非常方便了解脂类代谢通路和关键调控基因,从而为藻类的精准改良提供了可能。因为脂类物质是还原产物,所以其从头合成需要持续消耗机体中的NADPH(还原型辅酶II)来提供还原力,将基团(CH3-CO-)还原为脂肪酸的?;矗?CH2-CH2-)。但微藻产油的遗传和生化机制还未被完全揭示。

    本研究将调控的重点放在磷酸戊糖途径(PPP),PPP可以产生NADPH和磷酸戊糖,在动物中可以提供肝脏中50%-75%的还原当量。PPP在NADPH合成和维持机体氧化还原平衡起着非常关键的作用。而G6PD是催化PPP途径中的上游基因,且在各个物种都已经被报道,是脂类合成的关键基因。因此,作者就以这个基因为操纵目标,最终显著提高了三角褐指藻的产油量。

     

    研究结果

    图1 prG6PD的序列特性解析

    1.目标基因的序列分析和转基因构建微藻工程株

     

    首先作者对三角褐指藻G6PD(ptG6PD)进行了序列分析。目标序列的分析,在组学类文章里面经?;岢鱿?。例如,在植物DNA甲基化研究中,通?;岱治龈梦镏諨NA甲基化相关酶的序列特性;在植物抗病研究中,会分析抗病基因(R基因)的序列结构特点等。在分析中,最常见的分析条目包括:结构域分析、多物种保守性分析以及基因进化关系分析。

    比如在这篇文章正文中,作者分析了ptG6PD基因的结构域(图1A)和保守性。从中我们可以看出G6PD有两个结构域,其动植物种中非常保守。该基因如此保守,也间接暗示了其在脂类代谢中起着不可替代的作用。

    备注:图B中的4个物种分别为三角褐指藻(ptr)、毛霉菌(Mci)、紫花苜蓿(Mtr)、小鼠(Mmu)。

     

     

     

     

    然后作者构建prG6PD的过表达载体到三角褐指藻中,发现该基因的表达量和酶活都显著提高了——工程株构建成功。

     

    脂肪酸成分的变化

    通过气相色谱-质谱分析(GC-MS)分析,发现了基因工程株生产的脂肪酸成分发生了明显的变化。总饱和脂肪酸(SUM SFA)略微提高,其中C16:0占的比例最大。总单不饱和脂肪酸(SUM MUFA)提高了58.5%,包括C16:1,C18:1提高明显。但总多不饱和脂肪酸(SUM PUFA)在基因工程株中降低了22.7%。

     

    图2 prG5PD表达量提高了2.4 和2.7倍(A)

    图3 脂肪酸成分的变化

     

     

     

     

    图4 初生代谢物的含量变化

    2. 初生代谢物的含量也发生了变化(图4)

    3. 蛋白质谱和代谢组揭示基因工程微藻的代谢转化机理 

          通过iTraq蛋白质谱分析,发现上调的通路包括:脂肪酸合成和代谢、PPP(磷酸戊糖途径)、TCA(三羧酸循环)、粘多糖代谢、能量代谢和氨基酸代谢等。同时,发生下调的通路包括:脂肪酸延伸、碳水化物代谢、核酸代谢、尿素循环和维生素循环。这些上调的通路有利于更多的碳流向脂肪酸合成以及脂类的累积。

     

           而G6PD启动了磷酸戊糖途径的第一步,同时可以生成更多的NADPH用于脂类合成。代谢组分析也得出了与蛋白质谱相似的结论,包括PPP、糖酵解和TCA相关的代谢物发生显著的提升。

     

     

    参考文献

    [1]Jiao Xue,Srinivasan Balamurugan,Da-Wei Li,Yu-Hong Liu,Hao Zeng,Lan Wang,Wei-Dong Yang,Jie-Sheng Liu,Hong-Ye Li. Glucose-6-phosphate dehydrogenase as a target for highly efficient fatty acid biosynthesis in microalgae by enhancing NADPH supply[J]. Metabolic Engineering,2017,41.